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本试剂盒基于高碘酸-Schiff法(PAS)，用于PAGE凝胶或蛋白免疫印迹硝酸纤维素膜(NC膜)上糖蛋白的检测。整个染色过程约2.5小时完成。染色后的糖蛋白为品红色条带，背景为浅粉色或者无色。该试剂盒检测的灵敏度一般可以达到微克级别，但实际灵敏度与靶蛋白糖基化程度相关。本试剂盒不仅可以用于SDS-PAGE和2D电泳的凝胶检测，还可以用于NC膜的检测。

按照每次使用25mL糖蛋白染色试剂计算，本试剂盒可以染色8～10块mini-PAGE胶(8×10cm)或18～20张NC膜(8×8cm)。

• 配制3%醋酸溶液：将15mL自备的冰醋酸与485mL超纯水混匀，常温保存备用。
  
• 配制50%甲醇溶液：将250mL甲醇与250mL超纯水混匀，常温保存备用。
  
• 配制氧化试剂溶液：将本试剂盒提供的氧化试剂干粉全部转移到本试剂盒提供的250mL空塑料瓶中，然后加入250mL的超纯水，充分混匀溶解后得到氧化试剂溶液，常温保存备用。
  
• 配制还原试剂溶液：将本试剂盒提供的还原试剂干粉全部转移到本试剂盒提供的250mL空塑料瓶中，然后加入250mL的超纯水，充分混匀溶解后得到还原试剂溶液，常温保存备用。
  
• 配制1×SDS-PAGE上样缓冲液：取0.4mL 5×MonoClolor蛋白上样缓冲液，加入1.6mL超纯水，-20℃贮存备用。
  
• 配制阳性对照溶液：取阳性对照小管快速离心30秒，将粉末收集到管底；向管中加入1mL 1×SDS-PAGE上样缓冲液，所得辣根过氧化物酶溶液的浓度即为1mg/mL，适量分装成8～10管，留下一管当天使用，其余的放-20℃长期保存。对于8×10cm的凝胶来说，每条泳道加5～10μL的阳性对照溶液即可，上样前95℃处理5分钟。
  
• 配制阴性对照溶液：取阴性对照小管快速离心30秒，将粉末收集到管底；向装有1mg大豆胰蛋白酶抑制剂干粉的管中加入1mL 1×SDS-PAGE上样缓冲液，所得大豆胰蛋白酶抑制剂溶液的浓度即为1mg/mL，适量分装成8～10管，留下一管当天使用，其余的放-20℃长期保存。对于8×10cm的凝胶来说，每条泳道加5～10μL的阴性对照溶液即可，上样前95℃处理5分钟。
  
• 样品稀释：用5×MonoClolor蛋白上样缓冲液将样品浓度稀释为1mg/mL，其中上样缓冲液终浓度为1×。对于8×10cm的凝胶来说，每条泳道加5～10μL的样品即可，上样前95℃处理5分钟。

• SDS-AGE凝胶染色：
  
  • 以下步骤仅针对1mm厚度大小8×10cm的凝胶，1.5mm厚度凝胶或更大体积凝胶适当增加液体体积并延长操作时间。
    
  • 请在通风橱中进行以下操作。
  • 固定：取出电泳后的SDS-PAGE凝胶，加入50mL 50%甲醇溶液，摇床慢摇30分钟，弃甲醇溶液。
    
  • 漂洗：50mL超纯水洗涤凝胶两次，每次摇床慢摇10分钟，弃水。
    
  • 氧化：氧化凝胶中加入25mL氧化试剂，摇床慢摇15分钟，弃溶液。
    
  • 漂洗：50mL超纯水洗涤凝胶3次，每次摇床慢摇5分钟，弃溶液。
    
  • 染色：凝胶中加入25mL糖蛋白染色试剂，摇床慢摇15分钟，糖蛋白会在5～10分钟内显现品红色。弃染色溶液。
    
    • 若检测的糖蛋白含量较低，适当延长显色时间。
      
    • 若糖蛋白染色试剂中有晶体析出，只需取上清液即可，不要加热溶解晶体。
      
    • 染色步骤会产生有刺激性气味气体，请在通风橱中操作。
  • 还原：凝胶中加入25mL还原试剂，摇床慢摇15分钟，弃溶液。此时凝胶背景略带红色。
    
  • 漂洗：加入50mL 3%醋酸溶液，摇床慢摇洗涤胶块3次，每次10分钟，直至胶背景红色变浅，接近淡红色或无色，此时红色糖蛋白主带清晰可见。
    
  • 保存：胶块保存在50mL 3%醋酸溶液中。
  
  
• NC膜染色：
  
  • 预处理：用20mL 3%醋酸溶液洗涤膜两次，每次10分钟。
    
  • 氧化：将膜转移到10mL的氧化试剂中，轻轻振荡15分钟。
    
  • 漂洗：用10mL 3%醋酸溶液洗涤膜3次，每次轻轻振荡5分钟。
    
  • 染色：将膜转移到10mL糖蛋白染色试剂中，摇床慢摇15分钟，糖蛋白会在5～10分钟内显现品红色。弃染色溶液。
    
    • 若检测的糖蛋白含量较低，适当延长显色时间。
      
    • 若糖蛋白染色试剂中有晶体析出，只需取上清液即可，不要加热溶解晶体。
      
    • 染色步骤会产生有刺激性气味气体，请在通风橱中操作。
  • 还原：将膜转移到10mL还原试剂中，摇床慢摇15分钟，弃溶液。此时膜的背景略带红色。
    
  • 漂洗：加入10mL 3%醋酸溶液摇床慢摇洗涤膜3次，每次10分钟，直至膜背景红色变浅，接近淡红色或无色，此时红色糖蛋白主带清晰可见。
    
    • 检测后如果没有条带，可以用转膜后的PAGE胶进行检测，因为糖蛋白(尤其是高度糖基化的蛋白)转膜效果比较差。
  • 保存：膜可以保存在3%醋酸溶液中。